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致突变试验

作者:主编 时间:2023年02月15日 阅读:1106 评论:0

致突变试验是检验受试外来化合物是否具有致突变作用,并确定其对机体遗传物质及遗传过程的影响。突变是生物体的体细胞或生殖细胞遗传物质发生可察觉且可遗传的根本变化。生物体内的遗传物质是由无数脱氧核糖核酸组成的染色体。染色体上排列着很多基因,基因是遗传物质的基本功能单位,是遗传信息的携带者并决定生物体的性状。突变可分为基因突变和染色体畸变。基因突变仅限于染色体上一个或几个基因发生变化,染色体畸变则是整个染色体结构或数目发生变化。故凡具有致突变作用的化合物即有引起癌瘤的可能,致突变试验也可用作致癌物快速筛检试验。

致突变试验方法很多,其基本原理均为使一种生物体与受试物接触,然后用生物学或化学方法确定生物体是否发生突变,所用生物体包括微生物、昆虫、细胞株和哺乳动物等。食品毒理学试验常用的致突变试验方法有微粒体间介法、显性致死突变试验法、染色体畸变分析法、骨髓细胞微核试验法和姊妹染色单体交换试验法以及DNA修复合成试验。

微粒体间介法(艾姆斯法) 亦称鼠伤寒沙门菌/哺乳动物微粒体酶试验法,是一种细菌诱变试验法,因系Ames首先建立,也称艾姆斯法。原理是将一种突变型微生物与受试物接触,如受试物为一致突变物,则将使突变型微生物发生一次回复突变,重新成为野生型微生物。用一定的方法可鉴别突变型微生物和野生型微生物,并可确定该受试物是否具有致突变作用。

艾姆斯法中所用突变型微生物为鼠伤寒沙门菌TA1535、TA1536、TA1537、TA1538、TA98、TA100等菌株,最近又培养出更为灵敏的TA97和TA102等菌株。此种突变型菌株的共同特点是失去合成生长所必须的组氨酸能力,在组氨酸缺乏或不足的培养基上不能生长。进行致突变试验时,将突变型微生物于混有受试物琼脂平皿上培养。由于此种培养基缺乏足够的组氨酸,突变菌株本身又不能合成,故在正常情况下,突变型鼠伤寒沙门菌不能正常生长。但如受试物具有致突变作用,则此种突变菌株发生回复突变,重新成为野生型并恢复其合成组氨酸的能力,可在缺乏足够组氨酸的基本培养基上生长并形成菌落。根据野生型菌落出现情况,即可判定受试物是否具有致突变作用。由于大多数致突变物本身并不直接具有致突变作用,必须在体内经肝微粒体酶代谢活化后才呈现致突变作用。故进行试验时,还应加入大鼠肝微粒体,如受试物确为一致突变物,则可被其中的酶代谢活化,呈现致突变作用。肝微粒体的制备系将大鼠先用多氯联苯类化合物对肝微粒体酶进行诱导,然后取其肝脏匀浆经9000×g(相对离心力)离心,其上清部分即含有微粒体酶。使用时再向微粒体酶制备物中加入对致突变物代谢活化所必需的辅酶Ⅱ(NADP) 和6-磷酸葡萄糖。此种混合物称为S-9混合物。加入S-9混合物后,无论直接致突变物或需经代谢活化才具有致突变作用的间接致突变物均可检出。本法所用突变型菌株本身较为敏感,试验时又加入肝微粒体,故可检出其他方法不能检出的致突变物;且48~72h内即可取得结果,简便易行。不足之处是与哺乳动物相较,微生物的遗传信息较少,且较简单,其DNA修复机能不如哺乳动物完善,且缺乏免疫机能,不能充分反映哺乳动物机体内的实际情况。肝微粒体酶虽可催化大多数致突变物代谢活化,但确有少数致突变物的代谢活化不在肝中进行,采用本法即不能检出。但艾姆斯法确有很多优点,目前在致突变试验中是一种很重要的方法。

染色体畸变分析法 本试验直接观察受试物引起的生物细胞染色体结构或数目的致突变作用。一般可于骨髓细胞或外周血细胞(代表体细胞)或睾丸精原细胞 (代表生殖细胞) 进行。可以亚慢性毒性试验中的最大无作用剂量为高剂量组,以其若干分之一为低剂量组,并可设一中间剂量组。原则上高剂量组是动物可以耐受而不中毒的最高剂量,甚至有人主张采用可使动物发生轻微中毒而不死亡的最小有作用剂量。应该避免剂量过低,不能得出明确结果。所谓轻微中毒的具体指标,可为体重减轻、进食量下降。低剂量组可为肯定无毒性作用的剂量,或接近人类实际接触剂量或其若干倍的剂量。如从LD50考虑,可以LD50的1/50为最高剂量,以LD50的1/500为低剂量组。一般可设3个剂量组和一个对照组。另外可以一已知致突变物为阳性对照组。每组动物5只,雌雄分别同时进行。可用出生后8~13周的大鼠或小鼠,给予受试物5~7d,也有持续3个月者。

试验结束时,处死动物,取出骨髓或睾丸前2~5h注射秋水仙碱,使细胞有丝分裂停留在中期,以利观察分析。骨髓细胞或精原细胞经低渗处理、固定、制片和染色后检查染色体有无结构或数目异常。每个动物至少检查中期分裂细胞200个。

采用外周血可在Eagle 基本培养基中培养72h,同时加入受试物。培养结束前4~6h加入秋水仙碱,然后按上述方法处理染色并分析。外周血细胞体外培养染色体畸变分析可在人体进行,直接观察受试物对人体有无直接致突变作用。如用于动物,可连续进行观察数次而不需处死动物,适用于动态观察。

骨髓细胞微核试验 微核是染色体经致突变物作用后发生断裂,并有部分断片存留于间期细胞内而形成的一个或几个圆形结构,较普通细胞核小,直径约相当于红细胞的1/20~1/5,故称微核,嗜色情况与核质相同。由于微核出现是染色体断裂的结果,故可用于致突变试验;因微核的出现,表明遗传物质已发生突变。检查微核时,多于骨髓多染红细胞进行。骨髓取出后,用胎牛或小牛血清制成混悬液,离心后按骨髓细胞染色体畸变分析方法进行。微核检出率与染色体畸变率呈明显相关,可反映体细胞突变情况,且容易辨认,操作方法也较染色体畸变分析简便快速。但微核出现率较低,个体差异也较大,作为初步筛检更为适宜。

显性致死突变试验 是检验哺乳动物生殖细胞染色体畸变的试验。基本原理是根据哺乳动物生殖细胞发生突变时,常不能与异性生殖细胞结合,易出现受精卵于着床前死亡或着床后胚胎早期死亡现象。多用雄性大鼠或小鼠,先使其摄入受试物,摄入时间可为一次,或每日一次共5~7d,也可混入饲料喂饲动物3个月。一般一次摄入者试验效果不如后两种。雌性动物不摄入受试物。然后按1雄2雌比例同笼交配,小鼠连续交配6~8周,大鼠8~12周,每周更换一批雌鼠。雌鼠受孕后12~13d,将其剖腹取出子宫,记录活胎数、早期死亡胚胎数和晚期胚胎死亡数。一般以每剂量组受孕雌鼠平均早期胚胎死亡数,表示受试物致突变作用强弱。受孕雌鼠平均早期胚胎死亡数=早期胚胎死亡数/受孕雌性动物数

显性致死突变主要表现为早期胚胎死亡,故每剂量组受孕雌鼠平均早期胚胎死亡数可反映受试物的致突变作用。但在实际工作中,有些早期与晚期胚胎死亡不易严格区分,可按全部死胎数计算,因显性致死突变中晚期胚胎死亡极为少见,对结果并无影响。

本试验的特点是在哺乳动物进行,较微生物更能反映机体实际情况;以早期胚胎死亡为观察指标,简单明确,不需特殊设备,工作人员亦无需特殊训练,较睾丸精原细胞染色体畸变分析简便。但试验本身仅限于生殖细胞,不如突变微生物法灵敏。

姊妹染色单体交换试验 一般染色体是由2个染色单体组成。很多化学致突变物可使染色体上2个染色单体中的脱氧核糖核酸发生互换。所以细胞中染色单体的相互交换表明细胞受到致突变物的作用,借此可对化学致突变物进行检验。进行姊妹染色单体交换试验时,一般多用外周血淋巴细胞经短期体外培养,并用5-溴脱氧尿苷处理,染色后此种姊妹染色单体交换在分裂中期细胞最易观察。姊妹染色单体交换的发生可能与DNA断裂和重联有关,其分子基础尚未阐明。按照严格概念,姊妹染色单体交换并非突变,但其出现频率与染色体畸变率间呈相关关系,故可以姊妹染色单体交换出现频率、即每个细胞姊妹染色单体交换平均数作为化学致突变作用的指标。

DNA修复合成试验 致突变物及致癌物可使细胞DNA受到损伤,然后还将发生修复合成。根据这些现象,已设计有DNA合成抑制试验和程序外修复合成试验。DNA合成抑制试验的理论基础是细胞在DNA发生损伤后,其半保留复制受到抑制。程序外合成试验的理论基础是正常的DNA复制合成发生在细胞周期的S期;如DNA受损,则在S期以外,也可发生DNA合成。如向不处于S期的细胞提供DNA合成所需的胸腺嘧啶,则可根据DNA中参入胸腺嘧啶的数量来判断DNA受损情况。由于此种DNA合成不是发生在S期,故称程序外DNA合成试验。这一试验方法较为敏感,目前使用较多。

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